MEDIDAS DE SEGURIDAD GENERALES
Medidas de seguridad especificas
Materiales de laboratorio.
MEDIDAS DE SEGURIDAD GENERALES
Principales riesgos en los laboratorios
1. Quemaduras térmicas y químicas.
2. Lesiones en la piel y ojos por contacto con productos químicamente agresivos.
3. Cortaduras.
4. Intoxicación por inhalación de sustancias tóxicas.
Se recomienda
1.Ventilar muy bien las áreas antes de comenzar la rutina de trabajo.
2. Abrir puertas y encender extractores y campanas por lo menos 10 minutos antes de encender el aire acondicionado.
3. Leer y asegurarse de entender el procedimiento a seguir. Esto incluye leer las etiquetas de los reactivos que se requieran, conocer sus características y que hacer en caso de accidentarse. Cual es la sustancia neutralizante.
4. Usar, siempre que el trabajo lo amerite, el equipo de protección correspondiente.
5. Mantener el sitio de trabajo (mesones, campanas etc.) limpios y en orden.
6. No utilizar material de vidrio roto.
7. Trabajar sin prisa. Al caminar con un producto químico peligroso hacerlo con calma.
8. Conservar su equipo de seguridad limpio y en buen estado.
9. Lavarse muy bien las manos luego de usar sales o ácidos peligrosos.
10. Mantener las salidas y vías de escape despejadas.
MEDIDAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS
En caso de persona bajo fuego
Trate de quitar la prenda que está incendiándose.
Pida ayuda.
Si existe una ducha cerca trate de que la persona se bañe inmediatamente.
No intente apagar las ropas de las personas con chaquetas y/u otras prendas, esto lo único que hace es avivar mas el fuego.
Si dispone de alguna prenda fuerte o mantas, envuelva a la persona, sofocando el fuego.
No utilice extintores sobre la piel o la cara de la víctima, esto podría asfixiarlo.
En caso de salpicadura en los ojos
Aplique las siguientes medidas de seguridad cuando ocurran accidentes con líquidos químicos, fluidos corporales o partículas sólidas:
Los lentes de contacto deben ser removidos inmediatamente.
Realice un lavado de ojos de por lo menos 20 minutos, utilice abundante agua limpia y/o soluciones estériles.
Sostenga abiertos los ojos durante el lavado.
Acérquese inmediatamente al área de salud.
Proporcione toda la información necesaria sobre el tipo de material involucrado en el incidente.
En caso de partículas sólidas, no intente removerlas.
En todo caso reporte el incidente a su superior jerárquico inmediato.
En caso de intoxicación química
La intoxicación química se puede presentar por diferentes medios, ya sea por ingestión, inhalación o contacto. En todo caso, es importante seguir las siguientes recomendaciones:
Establecer el tipo de químico o material involucrado en el incidente.
En caso de presentarse intoxicación o quemadura por contacto, lavar con abundante agua, siempre y cuando el químico involucrado no provoque una reacción peor con el agua.
Prevenga la contaminación de otras áreas y otras personas, utilice equipo de bioseguridad para atender la víctima.
Trate siempre de brindar buena ventilación a la víctima, no lo sofoque con mantas o similares.
En caso de ser ingerido, no induzca a la víctima a vomitar, esto puede acarrear peores lesiones. En todo caso recurra al área de salud inmediatamente.
Reporte el incidente a su superior jerárquico.
En caso de derrames químicos
Antes de intentar contener algún tipo de derrame químico, esté completamente seguro sobre las condiciones de riesgo que se pueden presentar y no ingrese al área hasta no haberlas minimizado totalmente, siga estas recomendaciones:
No actúe precipitadamente.
Evalúe los riesgos y su seguridad, siga los protocolos establecidos para cada químico.
Retire todo material que reaccione con el químico derramado.
Si el químico en cuestión es inflamable aleje toda fuente de ignición o calor.
Trate de contener el derrame con material particulado adecuado para la clase de químico (arena, polvo absorbente, etc.)
Ventile lo máximo posible el área del derrame, pero evite generar contaminación por inhalación, si es necesario evacue el recinto.
Solicite apoyo médico y de la brigada de emergencias.
Disponga de los materiales y del producto recuperado, adecuadamente.
MATERIALES DE USO COMÚN EN EL LABORATORIO
1.- Vaso de precipitado Es un recipiente de vidrio, también denominado “Beaker”. Se utiliza para contener líquidos, preparar soluciones, efectuar reacciones de precipitación, titular soluciones, calentar líquidos, recoger líquidos de filtración, etc. La capacidad varía entre 5 y 3.000 mL. Los más usuales para trabajos de rutina son de 50, 100, 250, y 500 mL de capacidad.
2.- Erlenmeyer Recipiente de vidrio, forma cónica, se utiliza para calentar líquidos, preparar soluciones, titular, etc., Los hay sin tapa o con tapa esmerilada. Su capacidad puede ser de 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 mL, que son los más usuales.
3.- Cilindro graduado o Probeta graduada Es un cilindro de vidrio con una base, como muestra la figura, que lo mantiene vertical. Se utiliza para medir volúmenes de líquidos, que no requieren mayor precisión. Su capacidad puede ser de 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 mL, que son los más usuales. Existen probetas graduadas con tapa esmerilada para usos especiales.
4.- Pipetas Son tubos de vidrio. Se utilizan para medir volúmenes pequeños. Son de uso muy frecuente en los laboratorios de bioquímica. Existen dos clases: Aforadas y graduadas:
4.1.- Pipetas aforadas Existen con aforo simple y con doble aforo. Las de aforo simple tienen una sola marca y sirven para medir líquidos desde el aforo hasta la parte inferior. Las de doble aforo miden volúmenes de líquidos desde el aforo superior hasta el aforo inferior.
4.2.- Pipetas graduadas A diferencia de las pipetas aforadas, las graduadas tienen divisiones menores entre los extremos. Las graduaciones pueden ser en décimas de mL (1/10) o en centésimas de mL, miden cantidades menores y pueden ser adaptadas a aparatos micrométricos especiales para fines analíticos que requieren muestras.
Existen dos clases de pipetas graduadas.
a) Las que sirven para medir volúmenes desde el 0 (cero) hasta el extremo inferior de la pipeta.
b) Las que se utilizan para medir el volumen comprendido entre el 0 (cero) y la última graduación antes del extremo inferior . Entre las dos graduaciones extremas existen las décimas, centésimas o milésimas.
5.- Bureta Son tubos de vidrio graduados en milímetros (décimas o centésimas). Su capacidad oscila entre 2 y 100 mL. Las más usuales para los trabajos de rutina son de 25 a 50 mL (divididas en décimas de mL). Las hay también de divisiones menores (micro buretas). La parte inferior termina con una llave esmerilada y cónica. La llave se debe manejar con la mano izquierda, con la otra mano se sostiene el recipiente o la varilla de vidrio, según sea el caso, para agitar el líquido que se vierte. Los cuidados de limpieza son similares a los de las pipetas.
6.- Balón Es un recipiente de vidrio con forma esférica. Los hay sin tapa o con tapa esmerilada. Se utiliza para calentar líquidos, para destilación, etc. Existen balones especiales con paredes gruesas para soportar vacíos elevados. Capacidad: 25, 50, 100, 200, 250, 500, 1000 y 2000 mL.
7.- Matraz Semejante al balón, pero con la base plana. No es recomendable calentar líquidos en un matraz común, se utiliza para preparar soluciones. Su capacidad varía entre 25 y 2000 mL.
8.- Matraz aforado Tiene forma aproximada a la de una pera, con cuello estrecho y largo que permite efectuar una lectura exacta en el aforo (marca en el cuello) cuando se mide el volumen de un líquido contenido en él. Tiene tapa esmerilada. Se usa exclusivamente para preparar soluciones que exigen bastante exactitud. Capacidades más usuales: desde 10 hasta 2000 mL. Este recipiente se usa para contener una cantidad exacta de líquido y no para medir volúmenes.
9.- Cristalizador Recipiente de vidrio o porcelana, puede tener pico para verter los líquidos que contiene o sin él. Como su nombre lo indica, sirve para evaporar soluciones y obtener formas cristalinas. Son por lo general de mucho diámetro, para aumentar la superficie de evaporación.
10.-Mortero Los utensilios utilizados para la pulverización suelen ser de porcelana o vidrio; el mortero viene acompañado de otro utensilio llamado “mano de mortero”, que sirve para triturar y pulverizar el sólido dentro del mortero.
11.-Crisol Recipiente en forma cónica capaz de soportar altas temperaturas. Se usa entre otras cosas, para fundir sólidos. El material puede ser porcelana, cuarzo, acero, platino, etc. Se usa directamente sobre la llama o en hornos especiales llamados muflas.
12.-Embudo de separación De vidrio, generalmente en forma de pera; puede tener forma cilíndrica o esférica; con tapa esmerilada en la parte superior y llave esmerilada en la parte inferior. Sirve para separar líquidos no miscibles entre si.
13.-Desecador Recipiente de vidrio, por lo general grueso y resistente; con tapa que se adosa al cuerpo principal por borde esmerilado. Sirve para deshidratar sustancias que no pueden someterse a temperaturas de mechero. Contiene en su interior un deshidratante (CaCL2, H2SO4 ó silicagel, etc); además para que el proceso de secado sea de menor tiempo, se puede hacer al vacío por medio de una trampa de agua en comunicación con su parte superior (tapa), que está provista de una llave esmerilada.
14.-Kitasato Es un recipiente de vidrio cónico (semejante al Erlenmeyer), con un pico al costado para conectar a una trompa de vacío. Es de material resistente al vacío, y en la parte superior se adapta un filtro que puede ser de porcelana o vidrio, según el tipo de filtrado que se realice. El filtro Buchner es de porcelana, con base perforada para colocar en él un papel de filtro especial para vacío y allí se vierte el líquido a filtrar; éste último puede ser recogido (en caso que interese) en un tubo de ensayo.
15.-Tubos de Folin-Wu Son tubos de vidrio, con un estrechamiento en la parte inferior. Se emplean para análisis de glucosa en sangre.
16.- Tubos de ensayo Son tubos de vidrio, de diferente largo y diámetro, de múltiples usos en química analítica cualitativa y cuantitativa.
17.- Tubos de centrífuga De vidrio o de plástico, pueden ser cónicos, diseñados para resistir altas velocidades en las centrífugas; se usan para decantar soluciones que contengan sólidos en suspensiones. Es común el uso de estos tubos para separar el plasma de los glóbulos rojos de la sangre. Manipulación de pipetas Al tomar una pipeta con la mano, nunca se debe tocar con los dedos ni con ningún objeto el extremo inferior de la misma, para evitar introducir material extraño en la solución que se va a preparar o en la reacción en que verterá el líquido contenido en ésta. También es una medida de precaución sobre todo con aquellas pipetas con álcalis o con ácidos y que por descuido o equivocación el estudiante las toma nuevamente.Otra precaución que debe tomar el operario, es fijarse que la pipeta a usar esté perfectamente limpia. A veces el estudiante está trabajando en el laboratorio y deja una pipeta en posición tal, que el líquido sobrante se desliza hasta la parte superior de la pipeta, de manera que al, introducirla en la boca para aspirar, siente los efectos del ácido o álcali que ha llegado hasta esa zona.Una vez usada la pipeta, ésta debe ser descartada. Si hay necesidad de usarla nuevamente, debe ser lavada, enjuagada y secada para eliminar vestigios de líquido anteriores. Para usar una pipeta: Se introduce la pipeta dentro del líquido y se aspira por la parte superior (hay que tener cuidado de tener siempre sumergido el extremo inferior de la pipeta, de lo contrario se corre el riesgo de aspirar aire y líquido, que llegarán a la boca del operador, con el consiguiente peligro); una vez que la columna de líquido ha sobrepasado el nivel deseado, se retira de la boca y de inmediato se tapa el extremo superior con la punta del dedo índice, presionando en forma suave y dejando caer, en el mismo recipiente de donde se aspiró el líquido, la cantidad sobrante hasta llevar el menisco al cero de la pipeta. Esta operación se llama enrasado. Cuando se aspiran ácidos o bases fuertes nunca se aspira con la boca, en este caso es obligatorio el uso de pro-pipetas.
Error de paralaje en lectura de bureta y forma de evitarlo.
Al efectuar la lectura en una bureta se debe tener la precaución de no colocar la vista ni por encima ni por debajo del menisco del líquido que se desea medir, para evitar errores por defecto o por exceso.
Apreciación de medidas en buretas y pipetas
La apreciación (A) se define como la mínima lectura que puede hacerse con un instrumento de medición.Supongamos una pipeta de la cual se necesita saber cual es la mínima cantidad de líquido que podemos cuantificar y dispensar con ella. ¿Cómo proceder?:
Toda pipeta tiene en el extremo superior una leyenda que indica la capacidad de la misma en mL. Los números que se leen en la escala indican las fracciones del total de su volumen. Por ejemplo: tenemos una pipeta de 10 mL de volumen total, leemos a lo largo de la graduación los siguientes números: 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9, 10 mL, cada uno de estos números indica la cantidad de mL que partiendo del 0 (cero) se desea medir. Ahora bien, entre el número 2 y el 3 hay 1 mL, en este mL existen 10 divisiones pequeñas.
Para saber cuanto aprecia cada una de estas divisiones pequeñas se procede así:
10 divisiones……………………… 1 mL
1 división………………………… x
x = 1 mL x 1 div = 0,1 mL
10 div
Quiere decir que cada división pequeña de esta pipeta, aprecia un volumen de 0,1 mL (una décima de mL).
La fórmula general para calcular la Apreciación (A) de un instrumento es la siguiente:
A= lectura mayor - lectura menor
Nº. de divisiones
OPERACIONES ELEMENTALES EN EL LABORATORIO
1.- Calefacción
El calentamiento es una operación que se puede llevar a cabo utilizando diversos medios. Los que se emplean más frecuentemente en el laboratorio son: gas de petróleo (propano) y la electricidad; el primero se debe usar con sustancias que al calentarlas no sean inflamables a la vecindad de la llama. Los mecheros a gas, como el Punsen o el Fisher, son utensilios útiles en todo laboratorio químico. Generalmente, para calentar líquidos contenidos en recipientes de vidrio, se usa, entre la llama y el recipiente, una tela metálica con amianto.
2.- Pulverización
La pulverización es el procedimiento que consiste en reducir un sólido a partículas muy pequeñas. Existen sustancias que es necesario pulverizar para facilitar su solubilidad, puesto que la división de las partículas hace que se aumente notablemente la superficie que el sólido ofrece al disolvente, por lo tanto, se multiplica la interacción entre solvente y soluto. Los utensilios más comúnmente utilizados para la pulverización son los morteros, los cuales se construyen de porcelana o vidrio; además del recipiente, el mortero viene acompañado de otro utensilio llamado “mano de mortero”, que sirve para triturar y pulverizar el sólido dentro del mortero, con movimientos de tipo circular y no con golpes perpendiculares, que harían proyectar al exterior trozos de sustancias. Existen morteros especiales para trabajos de percusión. También existen morteros especiales de ágata (material muy resistente) los cuales sirven para pulverizar sustancias de mayor dureza que la común.
3.- Filtración
Consiste en hacer pasar una suspensión de un sólido (o de un gas) a través de un material poroso o filtro, a los efectos de separar las partículas del sólido, las cuales quedan retenidas en el filtro. El material más comúnmente usado en el laboratorio es el papel de filtro, el cual se clasifica según el tamaño de sus poros. Se debe seleccionar este papel de filtro de acuerdo al tamaño de las partículas que tenemos interés en separar. Para efectuar un filtrado en papel, se requiere un embudo; se utiliza un círculo de papel que se pliega para formar un cono adaptable a la superficie interna del embudo. El tamaño del embudo y del cono de papel de filtro, dependerá de la cantidad de suspensión a filtrar, y sobre todo de la cantidad de sólido a retener en el filtro. La solución se vierte en el filtro, con la ayuda de una varilla de vidrio la cual dirige el recorrido de la columna líquida, evitándose así pérdida por extravasación. Se debe procurar que el líquido nunca llene al cono de papel.
En ciertas oportunidades es necesario aumentar la velocidad de filtración, a tal efecto se puede efectuar lo que se llama “filtración al vacío”. Se utilizan en estos casos embudos especiales, que pueden ser de porcelana o de vidrio, conteniendo una placa filtrante con poros de varios tamaños, o bien se puede usar con papel de filtro especial para vacío. Este embudo (puede ser un Buchner), se adapta a un recipiente especial (Kitasato), y se conecta a una bomba de vacío. En la figura se ha representado el sistema más práctico para laboratorio, conectado a una trampa de agua que efectúa la succión en el kitasato y por lógica se produce la succión en el mismo; al disminuir la presión en el kitasato, se acelera la filtración. Puede presentarse el caso de que se necesite hacer uso del líquido filtrante, en este caso puede colocarse a continuación del embudo (Buchner) un tubo para recoger los líquidos mientras se hace el vacío.
4.- Decantación
Pueden existir mezclas heterogéneas de sólidos y líquidos o de varios líquidos de distinta densidad y que haya necesidad de separarlos. En caso de sólido y líquido, la mezcla se deja en reposo en un recipiente adecuado (por ejemplo, vaso de precipitación). Al cabo de un tiempo, los componentes sólidos más densos se depositarán en el fondo del recipiente. Luego, inclinando con cuidado el mismo, se puede verter el líquido sobrenadamente o se puede aspirar por una pipeta o un sifón. En caso de que la mezcla esté constituida por líquidos no miscibles (agua y aceite, éter y agua), se coloca la mezcla en un embudo de separación y se deja reposar, sosteniendo el embudo en un soporte adecuado; cuando los líquidos se han separado se abre la llave, dejando escurrir el líquido más denso. En el momento en que la superficie de separación de los líquidos llegue al nivel de la llave, se procede a cerrar ésta rápidamente; previamente se coloca un recipiente debajo del embudo de separación para recoger el líquido más denso.
5.- Centrifugación
Cuando se desea separar un componente de una mezcla, que demandaría mucho tiempo por decantación simple, o cuando la decantación no se produce dentro del tiempo requerido, se recurre al procedimiento llamado centrifugación. La centrifugación se lleva a cabo en equipos llamados centrifugas, que constan de un cabezal o rotor con soportes o porta – tubos, en los cuales se colocan los recipientes con el material a centrifugar. Este cabezal gira accionado por un motor a velocidad regulable. Por lo general, el cabezal o rotor está recubierto por una cámara metálica con una tapa o cubierta en la pared superior, que permite cerrarla en forma firme y segura. La rotación genera una fuerza centrífuga que aumenta la velocidad de sedimentación de las partículas más densas, permitiendo así la separación en un corto tiempo.
Deben tomarse las siguientes precauciones:
a. La mezcla a separar se debe colocar en tubos especiales para centrífuga, que pueden ser de vidrio o plástico reforzado, aptos para resistir las fuerzas a que son sometidos.
b. El nivel del líquido debe estar a 1 cm por debajo del borde del tubo.
c. Antes de colocar los tubos en la centrífuga, se deben equilibrar perfectamente en balanzas especiales que existen para tal fin. Se deben colocar los tubos de igual peso, forma y tamaño, en soportes diametralmente opuestos (en el rotor). Esto se logra en la práctica (si hay que centrifugar un solo tubo) ubicando el portatubos opuesto al que contiene la mezcla, otro tubo igual y al cual se le ha agregado agua hasta lograr el mismo peso. Una centrífuga que funcione con carga desequilibrada, puede sufrir graves daños.
d. Una vez puestos los tubos en el portatubos del cabezal, se cierra la centrífuga (tapa superior) y se acciona el dispositivo para ponerla en funcionamiento.
e. Cuando se ha cumplido el tiempo de centrifugación, se acciona el interruptor y se espera a que el rotor deje de funcionar por sí solo, antes de abrir la tapa. Nunca se debe frenar el cabezal con la mano u objeto alguno. Algunas centrífugas poseen un freno especial que se acciona por una palanca manual. Otras centrífugas, automáticas, tienen un reloj cuyas agujas se mueven a voluntad del operador, colocándolas de modo que la centrífuga se detenga en el tiempo deseado. De esta forma no hay que estar pendiente, ya que, cumplido el tiempo, el reloj al llegar al punto 0 (cero), acciona el interruptor en forma automática y el cabezal pierde velocidad hasta detenerse completamente.
6.- Destilación
La destilación, es la operación mediante la cual una sustancia líquida es convertida, por acción del calor, en vapores, que luego son enfriados en un condensador que los vuelve al estado líquido. La finalidad de la destilación es separar líquidos de otras sustancias disueltas en su composición. Existen mezclas homogéneas que están constituidas por 2 o más líquidos de diferentes puntos de ebullición; estos líquidos se pueden separar destilándolos; este procedimiento se llama destilación fraccionada.
Un destilador común consta de:
a. Un recipiente o balón, donde se coloca la mezcla a destilar.
b. Un dispositivo de calefacción, que va provocarle la ebullición de la mezcla.
c. Un refrigerante para condensar los vapores producidos en el balón descrito en el renglón.
d. El líquido destilado que vierte a lo largo del condensador, se recoge en un recipiente colector.
En la boca del balón (a) se coloca un termómetro (e), cuyo bulbo debe quedar a la altura del tubo de desprendimiento y permitir así medir la temperatura del vapor que se produce. En algunos casos puede ser necesaria la destilación a presión reducida; para esto, el destilador y el recipiente colector del destilado, deben constituir un sistema que se conecta a una bomba de vacío.
Tips prácticos para el cultivo de células animales in vitro
Los medios de cultivo contienen una mezcla de carbohidratos, aminoácidos, sales, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, indicadores y amortiguadores de pH.
La concentración de sales tiene que ser isotónica, es decir, con el mismo potencial osmótico que el fluido intracelular.
Se incluye bicarbonato como sistema amortiguador en conjunto con el dióxido de carbono de la atmósfera ( 5% CO2 y 95% aire).
El pH debe ser 7,4.
El indicador de pH suele ser rojo de fenol. Al cambiar de rojo a amarillo indica disminución de pH causada, principalmente, por contaminación bacteriana.
Por lo general, se agrega suero fetal bovino, pero es costoso y suele ser una mezcla variable entre distintos lotes. Para evitar este factor de variabilidad puede sustituirse el suero por factores de crecimiento aislados, que promueven la proliferación de tipos específicos de células de mamíferos en cultivos in vitro.
Es importante añadir antibióticos para evitar infecciones en el cultivo. Es común utilizar penicilina y estreptomicina.
Se requiere aireación para satisfacer los requerimientos de oxígeno (0,5 micromoles de oxígeno por cada 1.000.000 de células por hora).
Incubando el cultivo durante 15 minutos con una cantidad pequeña de tripsina se desprenden las células del soporte sólido en el que crecen, permitiendo su posterior aislamiento, ya sea para realizar un sub-cultivo o para un estudio posterior.
Fases del crecimiento de las células en cultivos in vitro
Latencia
Crecimiento exponencial
Estacionaria
Fase de Latencia
Es un período de crecimiento cero, cuando las células se inoculan por primera vez en el medio de crecimiento. La duración de ésta fase depende del tipo de células y de su estado metabólico al momento de su inoculación.
Fase de crecimiento exponencial
Es un período de continua duplicación celular. Suele tener una duración de entre 15 y 25 horas, a razón de 1.000.000 a 2.000.000 de células por centímetro cúbico.
Fase estacionaria
Ocurre posterior al crecimiento, cuando ya no hay cambios en la densidad del cultivo. Esta fase se presenta cuando ya se han agotado los nutrientes o se han acumulado metabolitos inhibidores dentro del medio de cultivo, que se han producido como consecuencia del mismo crecimiento celular. Las células pueden continuar creciendo si se realiza un sub-cultivo en medio fresco.
CULTIVOS CELULARES
Preparación del medio RPMI-1640 con rojo de fenol (Medio Básico)
- Disolver el contenido de un frasco comercial de medio RPMI-1640 en 800 mL de agua destilada, desionizada y esterilizada (DDE).
- Agregar 2 g de bicarbonato de sodio.
- Enrasar a 1 L con agua DDE.
- Agitar durante 2 horas.
- Filtrar bajo campana de flujo laminar con filtro 0,45 µm.
- Adicionar 10 mL de antibiótico (penicilina-estreptomicina 10.000 U/mL a una concentración final de 100 U/mL).
- Dividir en 2 frascos estériles de 500 mL cada uno.
- Almacenar a 4°C.
Preparación de HEPES 500 mM (pH 7,4) (PM del Hepes es 238,3 g/mol)
- Pesar 11,92 g de HEPES y disolver en agua DDE hasta 100 mL.
- Filtrar con milipore.
- Distribuir en tubos estériles de 15 mL de capacidad.
- Almacenar a -20°C.
Inactivación del Suero Fetal Bovino (SFB)
El SFB adquirido comercialmente debe ser inactivado para lo cual se descongela en baño de María a temperatura ambiente y se incuba a 56°C durante 30 minutos.
Medio específico para el cultivo de células
Dependiendo del tipo celular, se prepara un medio de cultivo específico. Para algunas células, como las células de leucemia linfocítica, puede utilizarse un medio específico preparado como se indica a continuación:
- Colocar 70 mL de medio básico estéril en un frasco de vidrio esterilizado.
- Añadir 10 mL de SFB inactivado.
- Agregar 500 µL de L-Glutamina 200 mM.
- Ajustar el pH con HEPES 500 mM (pH 7,4).
- Enrasar a 100 mL con el medio básico estéril.
- Almacenar a 4°C.
- Al momento de utilizarlo debe estar a 37°C.
Frascos de cultivos
Existen frascos de cultivos de diferentes tamaños:
Pequeño de 25 mL de capacidad. A estos se les agrega 7 mL de medio específico.
Mediano de 75 mL de capacidad. A estos se les agrega 25 mL de medio específico.
Grande de 175 mL de capacidad. A estos se les agrega 40 mL de medio específico.
Descongelamiento de las células
- Retirar los crioviales del tanque de almacenamiento y descongelarlos en baño de María a 37°C.
- Añadir el contenido del criovial a un tubo de centrífuga estéril, de 15 mL de capacidad, al cual se le añadió previamente 10 mL de medio específico. Este tubo debe mantenerse sumergido en baño con hielo para evitar daños producidos por el dimetil sulfóxido (DMSO) contenido en las células congeladas.
- Centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos a 4°C.
- Descartar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 3 mL de medio específico.
- Añadir la suspensión a un frasco de cultivo pequeño que contiene ya 7 mL de medio específico.
- Incubar a 37°C con 5% de CO2 por 24 horas.
- Repetir la centrifugación y repetir la resuspensión.
- Incubar a 37°C con 5% de CO2 por 48 a 72 horas para luego iniciar los experimentos.
Preparación del cultivo celular
- A partir de un frasco de suspensión celular, tomar, con pipeta estéril, una porción de suspensión y colocarlo en un vial para proceder al contaje en la Cámara.
- N° de células/mL en el cultivo inicial = N° de células contadas x 104
- Calcular el volumen que va a sustraerse del frasco inicial, para una concentración final de 100.000 células/mL:
Vci= (100.000 células/mL x 10 mL) /(N° de células/mL del cultivo inicial)
- Cada frasco de subcultivo se incuba a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 por 48 a 72 horas.
- Realizar un pase: para esto se observa a microscopio la integridad de la membrana celular, se descarta contaminación, se verifica la existencia de racimos o acúmulos. Si el cultivo está apto, se agita suavemente para separar las células, se realiza un contaje en cámara para calcular la densidad y se transfieren a un nuevo frasco de cultivo a razón de 100.000 células/mL en un volumen final de 10 mL de medio específico. Este pase se realiza para mantener el cultivo. El resto de las células en cultivo se centrifugan para montar los experimentos.
Congelamiento de las células
- Se cuentan las células con la Cámara de Neubauer. Se espera una densidad cercana a 106 células/mL.
- Centrifugar todo el volumen del cultivo celular en tubos cónicos estériles de 15 mL de capacidad, a 1.500 rpm por 10 minutos a 10°C.
- Descartar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado con 2 mL de medio de congelamiento frío. Mantener la suspensión en baño con hielo.
- Colocar 1 mL de la suspensión en crioviales para almacenar.
- Mantener a 4°C durante 20 minutos.
- Mantener a -20°C durante 3 minutos.
- Mantener a -70°C durante 24 horas.
- Almacenar en nitrógeno líquido.
Medio de congelamiento
45 % de medio específico
45 % de SFB inactivado
10 % de DMSO
Experimentos para medir apoptosis celular por microscopía de fluorescencia.
Se utilizan como reactivos dos soluciones de:
- Naranja de acridina (NA) 100 mg/mL
- Bromuro de etidio (BE) 100 mg/mL
- Colocar en viales protegidos de la luz 25 microlitros de suspensión celular (procedentes de los experimentos) con 1 microlitro de la mezcla NA/BE diluída 1:10, con una concentración final de 10 mg/mL de cada componente.
- Mezclar suavemente.
- Colocar entre lámina y laminilla 10 microlitros de la suspensión con la mezcla.
- Examinar con objetivo seco de 40X o 60X utilizando epiiluminación y una combinación apropiada de filtros para observar la fluorescencia.
- Contar el número de células necróticas, apoptóticas y viables en un total de 100 células.
- Las células necróticas se identifican por su color rojo ladrillo (o naranja).
- Las células apoptóticas se observan de núcleo verde brillante, cromatina naranja condensada o fragmentada.
- Las células viables se observan de núcleo verde con poco brillo, el citoplasma puede ser verde o naranja.
La naranja de acridina entra en todas las células y tiñe el núcleo de verde. El bromuro de etidio sólo ingresa a la célula cuando se pierde la integridad de la membrana citoplasmática y tiñe el núcleo de rojo ladrillo. El BE domina sobe la NA. Así, las células vivas se observan al microscopio de fluorescencia con un núcleo verde normal, las células apoptóticas tempranas con núcleo verde brillante y cromatina condensada o fragmentada. Las células apoptóticas tardías tienen cromatina naranja fragmentada y condensada. Las células que han muerto por necrosis tienen un núcleo rojo ladrillo estructuralmente normal.
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Fundamento teórico
Las proteínas son moléculas complejas, formadas por secuencias de aminoácidos unidos entre sí a través de enlaces peptídicos, presentes en todos los seres vivos y con funciones muy diversas: catalítica, estructural, de movimiento, de defensa, regulación, transporte, almacenamiento de nitrógeno o respuesta a las agresiones abióticas. La información genética se expresa a través de la síntesis de las proteínas. Algunas enfermedades hereditarias son producidas por alteraciones de la secuencia de aminoácidos de proteínas específicas. Ciertos organismos patógenos producen sustancias venenosas denominadas toxinas, muchas de las cuales son proteínas que ejercen su acción o bien dañando las membranas celulares, o interrumpiendo funciones celulares o inhibiendo la función en las sinapsis de las células nerviosas. Las proteínas vegetales constituyen una importante fuente de aminoácidos para la alimentación de humanos y animales. Numerosas proteínas extraídas de diversas plantas han sido de gran utilidad en la tecnología actual, como por ejemplo en la industria de alimentos y en la industria farmacéutica. El potencial tecnológico de las proteínas ha despertado interés por los científicos del mundo entero, quienes han desarrollado y mejorado técnicas para lograr su extracción, purificación y caracterización.
Generalmente, para obtener una proteína de alta pureza deben aplicarse varias técnicas de forma secuencial. La extracción de una proteína comienza con la ruptura y homogeneización de las células, después de lo cual se realizan sucesivos pasos de centrifugación diferencial.
Después de obtener la fracción que contiene la proteína pueden utilizarse varios métodos relativamente crudos, como el salting out, que permite precipitar proteínas utilizando concentraciones elevadas de sales como el sulfato de amonio [(NH4)2SO4]. Este paso permite separar la fracción deseada debido a que cada proteína tiene un punto de salting out característico (las proteínas que no se requieren permanecen en disolución y se descartan), es decir, el efecto de la concentración salina sobre la pérdida de la solubilidad varía de una proteína a otra. Por ejemplo, el fibrinógeno precipita a una concentración de sulfato de amonio de 0.8 M, mientras que se requiere una concentración de 2.4 M para precipitar la albúmina sérica.
Luego de la precipitación con sulfato de amonio suele aplicarse, de forma rutinaria, diálisis a través de una membrana semipermeable, para eliminar impurezas de bajo peso molecular, como sales, disolventes y detergentes que atraviesan los poros de la membrana y salen de la bolsa de diálisis, quedando retenidas dentro de ellas solo las moléculas con dimensiones mayores al diámetro de los poros de la bolsa.
Para conseguir una mayor purificación se deben aplicar técnicas más sofisticadas como la cromatografía y la electroforesis.
La cromatografía fue diseñada originalmente para separar sustancias de bajo peso molecular, como los azúcares y los aminoácidos, no obstante se ha convertido en una herramienta de gran aplicación en la separación de proteínas. Se basa en la separación de diferentes componentes de acuerdo con sus propiedades moleculares, como el tamaño, la forma, el peso, la carga iónica o determinadas afinidades de unión.
Existen varios métodos cromatográficos de los cuales los más empleados para separar proteínas son: filtración en gel, intercambio iónico y afinidad. En cualquier caso, la mezcla proteica se disuelve en un líquido conocido como fase móvil. Al pasar las moléculas de proteína a través de la fase estacionaria (una matriz sólida), se separan unas de otras debido a la diferente distribución entre las dos fases. El movimiento relativo de cada molécula es consecuencia de su capacidad para permanecer asociada a la fase estacionaria mientras continúa fluyendo la fase móvil.
Cromatografía de filtración en gel: Permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y forma. La muestra se aplica en lo alto de una columna rellena de bolitas porosas hechas de un polímero gelatinoso insoluble pero muy bien hidratado, como el dextrano o la agarosa (son carbohidratos) o bien la poliacrilamida. Las moléculas que son mayores que los poros del gel quedan excluidas y por lo tanto se mueven rápidamente a través de la columna. Las moléculas que son menores que los poros del gel difunden dentro y fuera de los poros, de forma que se retrasa su movimiento a través de la columna. Cuanto menor es el peso molecular, más lento es el movimiento, debido a que las moléculas menores pueden entrar en las esferas, pero las mayores no. La diferencia de estas velocidades separa la mezcla de proteínas en bandas que se colectan separadamente. El Sephadex, la Sepharosa y el Bio-gel, utilizados habitualmente, son distintas preparaciones comerciales de geles, con un diámetro medio de 100 mm (0.1 mm).
Cromatografía de intercambio iónico: Permite la separación de las proteínas en función de su carga eléctrica. Las resinas de intercambio aniónico, que están formadas por materiales con cargas positivas, se unen de forma reversible con los grupos que poseen carga negativa de la proteína. De igual forma, las resinas de intercambio catiónico se unen a los grupos con carga positiva. Por ejemplo: si una proteína tiene, a pH 7, una carga positiva, normalmente se unirá a una columna rellena de bolitas conteniendo grupos carboxilato, mientras que una proteína cargada negativamente no se unirá. Después de eliminar las proteínas que no se unieron a la resina, se recupera la proteína que interesa por medio de un adecuado cambio del pH del disolvente y/o de la concentración salina. Un cambio del pH altera la carga neta de la proteína y entonces ésta podrá ser liberada. Una proteína con carga positiva unida a la columna podrá ser eluida aumentando la concentración de cloruro de sodio u otra sal en el tampón eluyente. Los cationes de sodio compiten con los grupos positivos de la proteína en su capacidad de unirse a la columna. Las proteínas de baja densidad de carga positiva se eluirán primero, seguidas por las de mayor densidad de carga. Así mismo, el comportamiento de las proteínas en este tipo de columnas puede verse influenciado por su afinidad con la matríz soporte. Para separar proteínas con cargas negativas (aniónicas) se utilizan columnas con relleno cargado positivamente como por ejemplo dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosa). Inversamente, las proteínas positivas (catiónicas) pueden separarse por columnas negativas como las de carboximetilcelulosa (CM-celulosa).
Cromatografía de afinidad: Utiliza las propiedades biológicas de cada proteína, es decir, se basa en una afinidad de unión no covalente especial entre la proteína y una molécula especial (llamada ligando). El ligando está unido de forma covalente a una matríz insoluble que se coloca en una columna. Después de pasar a través de la columna el conjunto de moléculas, se eluyen las proteínas no enlazadas, quedando atrapadas solo las moléculas de interés, capaces de unirse al ligando. Finalmente se logra la elución de la proteína deseada, o bien por adición de una concentración elevada de una forma soluble del ligando, o alterando las condiciones que afectan la unión, como el pH o la concentración salina. Por ejemplo, la concanavalina A (Con A), una proteína (lectina) abundante en las semillas de Canavalia ensiformis, puede purificarse haciendo pasar el extracto crudo a través de una columna que contenga residuos de glucosa unidos covalentemente a la resina. La Con A se adhiere a la columna a causa de la afinidad de ésta por los residuos de glucosa, mientras que la mayoría del resto de las proteínas no son adsorbidas. La Con A puede ser posteriormente liberada de esa columna mediante adición de una solución concentrada de glucosa. La glucosa disuelta desplaza a los residuos de glucosa unidos a la columna de los puntos de enlace con la Con A.
Electroforesis:
Una molécula con una carga neta se desplaza en un campo eléctrico. Este fenómeno, llamado electroforesis, ofrece un método poderoso para separar las proteínas y otras macromoléculas como el ADN y el ARN. Las proteínas se moverán en un campo eléctrico de acuerdo a su carga neta. En general, moléculas con carga neta positiva migrarán hacia el electrodo con carga negativa (cátodo), mientras que las moléculas con carga neta positiva se mueven hacia el electrodo con carga positiva (ánodo). Las moléculas sin carga neta no migran en el campo eléctrico.
Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre sobre geles (o sobre soportes sólidos como el papel) y nunca sobre disoluciones libres, debido a que los geles suprimen las corrientes de convección producidas por pequeños gradientes de temperatura y sirven de tamices moleculares que potencian la separación. Las moléculas más pequeñas que los poros del gel se desplazan más fácilmente a través de él, mientras que las moléculas mayores que los poros del gel permanecen casi inmóviles.
El medio en el cual se ejecuta la electroforesis debe ser estable, que disminuya la convección y no reaccione con la muestra o que de ningún modo retarde su movimiento uniéndose a ella. El medio ideal para la separación de proteínas es el gel de poliacrilamida, por ser químicamente inerte y formarse con facilidad mediante polimerización de la acrilamida. Los compuestos utilizados para construir la matríz polimerizada son: acrilamida, N,N´-metilen-bis (acrilamida), tetrametilen diamina (TEMED) y persulfato de amonio. Cuando el persulfato de amonio se disuelve en agua, forma radicales libres, que, al ponerse en contacto con la acrilamida genera una reacción con la conservación del radical libre en la molécula de acrilamida. Esta acrilamida activada reacciona en la misma forma con sucesivas moléculas de acrilamida para producir una larga cadena de polímeros. La formación del gel requiere enganchar varias cadenas juntas o reticularlas unas con otras, lo que se consigue efectuando la polimerización en presencia de N,N´-metilen-bis (acrilamida).
Electroforesis de proteínas
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. Algunos consejos prácticos.
Preparación de acrilamida:
Al 30%: Se prepara con 29% de acrilamida y 1% de N,N´-metilen-bis-acrilamida.
Al 50%: Se prepara con 48.33% de acrilamida y 1.66% de bisacrilamida.
Armar la cámara de electroforesis:
Juntar dos placas de vidrios con separadores en los extremos y sujetar con ganchos. Colocar sobre una lámina de vidrio.
Preparación del gel de sellado:
Es igual al gel de corrida pero con más catalizador:
A 1 ml de mezcla (sin persulfalto ni temed) se agrega: 8ml de persulfato de amonio y 6ml de temed, al momento de aplicarlo. Agregar este buffer de sellado por ambos extremos hasta llenar el borde inferior. Dejar secar.
Luego se agrega el gel de corrida, desde un único punto, hasta llenar la cámara a una altura que permita que quede un espacio superior igual al doble de la longitud de los bolsillos del peine. Agregar inmediatamente un pequeño volumen de agua destilada para formar una superficie uniforme.
Dejar secar.
Extraer el agua por absorción con papel de filtro.
Agregar el gel de empaquetamiento (gel superior)
Preparación de los geles:
a) Gel de Corrida (gel inferior)
-Para proteínas de tamaños entre 10 y 90 kDa se preparan geles de corrida al 10% (de acrilamida ya preparada al 30%)
-Para proteínas de menor tamaño y péptidos se utilizan geles de corrida al 15-20 % (de acrilamida ya preparada al 30%)
-Para proteínas de alto peso molecular se utilizan geles preparados con 7,5 % (de acrilamida ya preparada al 30%)
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Preparación de las muestras
La muestra colocada en cada carril debe contener entre 10 y 20 µg de proteína dependiendo de su pureza. Mezclas de proteínas pueden ser aplicadas a razón de 20 µg de proteína. Proteínas purificadas no deben colocarse por encima de 10 µg en cada carril, para evitar bandas excesivamente gruesas y poco definidas.
Las muestras colocadas en un gel de electroforesis no pueden contener sulfato de amonio. El sulfato de amonio daña el proceso debido a que, al aplicar la corriente, los iones de sulfato cargados negativamente comienzan a migrar hacia el polo positivo. Como las proteínas también están cargadas negativamente son repelidas por el sulfato, en consecuencia, se retrasa la migración de las proteínas provocando una mala separación en el gel.
Las muestras de proteínas son mezcladas en una proporción 1:1 v/v con un tampón Tris-HCl 62.5 mM, pH 6.8, que contiene 10% de glicerol, 5% de mercaptoetanol, 2.3% de SDS y trazas de azul de bromofenol, (el volumen final puede ser de 12,5 a 25 ml) y desnaturalizadas a 100ºC durante 4 minutos.
Las condiciones de migración pueden ser 30 mA en el gel superior y 20mA en el gel inferior.
El tampón de migración contiene: Tris 25 mM pH 8.3, glicina 250 mM y 0.1% de SDS.
Tinción del gel
Al finalizar la electroforesis, las proteínas son teñidas sumergiendo el gel en una solución de coloración (0.25% de azul de Coomassie R250, 50% de metanol y 5% de ácido acético) durante toda la noche con agitación suave. Posteriormente se realizan dos lavados del gel con una solución decolorante preparada con 10% de etanol y 7% de ácido acético, luego de lo cual se deja sumergido en esta solución decolorante a 40ºC, con agitación moderada, durante 30 minutos o hasta que se observan con nitidez las diferentes bandas y se aclara el fondo.
Tinción con nitrato de plata
Cuando la cantidad de proteína aplicada sobre el gel es menor a 10 µg no se detectan las bandas cuando se tiñe con azul de Coomassie, en ese caso es necesario realizar un procedimiento de tinción de mayor sensibilidad, que utiliza nitrato de plata.
El protocolo a continuación ha sido probado en el laboratorio, dando excelentes resultados. Es un método corto y rápido en comparación con los tradicionalmente utilizados y está basado en una combinación de métodos:
- Sumergir el gel en una solución de Ácido tricloroacético al 10% durante 20 minutos.
- Retirar de allí y sumergir en una solución con 10 % de etanol y 7 % de ácido acético durante 10 minutos.
- Retirar de allí y realizar lavados con agua destilada y desionizada.
- Sumergir en una solución de nitrato de plata al 0,2 % durante 30 minutos, protegido de la luz.
- Lavar con agua destilada.
- Las bandas se revelan sumergiendo el gel en una solución con carbonato de sodio al 3 % + formaldehído 0,5 mL/L, realizando cambios continuos de solución hasta la aparición de las bandas.
- Cuando las bandas se distinguen con nitidez se extrae el gel rápidamente y se sumerge en una solución de ácido acético al 5% para detener la reacción.
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